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多肽合成步骤

1.1 树脂的充分溶胀

      称取2.0 g 空白Wang树脂于洁净干燥的反应管中,加入15 mL DMF,室温活化30 min左右。

1.2 接第一个氨基酸

      室温下,通过沙芯抽滤掉上步溶剂,加入1 mmol 5倍摩尔过量的 C端第一个氨基酸,5倍摩尔过量的DMAP,5倍摩尔过量的DIC,DMF做溶剂室温反应3 h。反应完毕用DMF洗4~6次,每次5-6 mL。再加入体积比为1:1的适量吡啶和乙酸酐,反应30 min。反应完毕用DMF洗4~6次,每次5-6 mL。(作用:封闭掉没有反应的空载树脂上的活性微点。)

1.3 Fmoc保护基的离去

      抽滤去掉上步溶剂,将10 mL 20%的哌啶DMF溶液加入到树脂中,N2搅拌10 min后滤出溶液,再加入10 mL 20%的哌啶DMF溶液,N2吹动搅拌5 min再滤去溶液,反复重复此操作两次后,用DMF洗4次,甲醇洗2次,每次5-6mL。

1.4 茚三酮检测脱除效果

      取出少量树脂,用甲醇洗三次,加入茚三酮,KCN,苯酚溶液各一滴,105℃–110℃加热5 min,变深蓝色为阳性反应,说明脱除完全,即可进行下步反应;若呈无色,说明保护基没有脱除完全,则需要重复以上脱保护操作。

1.5 接第二个氨基酸及Fmoc保护基脱除

      称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸,3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的HOBT于反应管中,加入适量DMF溶液使其完全溶解后,再加入10倍摩尔过量的(纯的)DIEA,室温反应40 min,用DMF洗4~6次,每次5-6mL。取少量树脂用茚三酮检测试剂检测,显无色,然后加入10 mL 20%的哌啶DMF溶液脱Fmoc,进行两次,分别为10min、5min,之后用DMF洗4次,甲醇洗2次,每次5-6mL。取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测,检测为蓝色,即可进行下一步反应。

1.6 以此类推,重复2.6的步骤,直到合成到N端最后一个氨基酸,去掉Fmoc保护基,然后抽干。

1.9树脂的脱落及纯品分离检测

      最后用三氟乙酸切割液(95% TFA:2%TIS:2%EDT:1% H2O)切割2 h,抽滤反应液,得多肽的三氟乙酸溶液,将裂解液用氮气尽量吹干,再用乙醚沉淀,离心,然后用乙醚洗3~5次,得白色固体,用纯水溶解后,经HPLC脱盐提纯,冻干后析出晶体,取少量MS分析。



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